[所屬分類:技術資料] [發布時間:2020-8-7] [發布人:管理員] [閱讀次數:] [返回]

延遲培養法可以允許水樣經濾膜過濾后，將濾膜裝運、輸送到實驗室，進行培養并完成檢驗。在常規的檢驗步驟不能實現時，例如在水樣運輸的途中不能保證所要求的溫度，或者在采樣后不能在允許的時間內進行檢驗等都可應用延遲培養。

延遲培養法和標準的濾膜法比較表明兩者的數據可以相符。延遲培養試驗基本上是依照檢驗總大腸菌群的濾膜法進行修正而來的。此法是將水樣在現場過濾后，將濾膜置于培養基上，然后運到實驗室。這種運送濾膜的培養基能在運輸過程中保持大腸菌群細菌的活性，但又不允許它們在運輸到實驗室的途中長成可見的菌落。

延遲培養試驗兩種可選擇的方法是M-遠騰氏法和LES法。

1．培養基

(1) M-遠騰氏法

OM-遠騰氏培養基。

OM-遠騰氏防腐培養基：按M-遠騰氏培養基配制，每升再加3.84g苯甲酸鈉。另外，要根據水樣情況來決定是否把環己亞胺加到M-遠藤氏防腐培養基中。如己發現有蔓生霉菌或真菌的水樣，按每100m1M-遠藤氏防腐培養基加入50mg環己亞胺。

(2) LES法

①LES-MF保存性培養基。

② LES遠藤氏瓊脂培養基。

2．步驟

(1)采樣前的準備

①過濾裝置：以無菌操作把濾器裝置裝好。

②水樣量的選擇：待過濾水樣量是根據所預測的細菌密度而定的，對總大腸菌群做濾膜試驗應過濾水樣的參考體積。一個理想的水樣體積，可以產生大約50個大腸菌群細菌菌落，而全部類別的菌落數則不超過200個。當過濾水樣（稀釋的、或未稀釋的）體積少于20m1時，應在過濾之前加少量的無菌稀釋水到過濾漏斗中，以便水量的增加有助于懸浮的細菌均勻分布在整個過濾表面。

③過濾：用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，穩妥地固定好濾器。將適量的水樣注入濾器中，加蓋，開動真空泵即可抽濾除菌。

④培養皿：無菌的、密封保濕的塑料培養皿50mm×12mm。這種培養皿重量輕，不易破碎。緊急情況下，也可使用無菌的玻璃培養皿，但要用塑料薄膜或類似的材料包裝起來。

(2）水樣的保存和運輸

①用滅菌鑷子把一片滅菌吸收墊放在一個滅菌的培養皿底部，并吸收足夠的、己選擇好的，在運輸過程中可抑制大腸桿菌生長的運輸培養基（如M-遠騰氏防腐培養基或LES-MF保存性培養基），使墊片浸濕飽和（小心地吸去剩余培養基）。

②用滅菌鑷子從過濾設備上取下濾膜，放在已用運輸培養基飽和過的吸收墊上。緊閉塑料培養皿就能保持高濕度，防止濾膜損失水分。注意運輸途中不使濾膜脫水，但也不要使皿中有過多的液體。把放置有濾膜的培養皿放在適當的容器里送到實驗室去做試驗。運輸時，樣品可在此種培養基上保持72h而無明顯生長。這種運輸培養基可郵遞或普通方法運送。當遇到高溫時，偶然能在運輸培養基上發現有菌落生長。

(3）轉移和培養

在實驗室里，以無菌操作把濾膜從運輸用的塑料培養基皿上移到含有M-遠滕氏培養基或LES-遠滕氏瓊脂培養基的第二個無菌的平皿中。

①M-遠騰氏方法：從M-遠騰氏防腐培養基上把濾膜轉移到含有沒有抑菌劑的M-遠騰氏培養基的吸收墊平皿中，在37℃±1℃培養20-22h。

②ES法：把濾膜從LES-MF保存性培養基轉移到LES-遠騰氏瓊脂培養基里，在37℃±1℃培養20^22h.在轉移時，如果不用放大鏡已可觀察到清晰的菌落，則在放進37℃±1℃的溫度培養16-18h之前，將含有轉移濾膜的培養皿先存放在5-10℃處。縮短培養時間是為檢驗員提供一種控制細菌生長過度或菌落光澤消散的辦法，以免影響對大腸菌群的菌落計數。

3．總大腸菌群數的估算

挑選符合下列特征的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。

紫紅色，具有金屬光澤的菌落；深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；淡紅色，中心色較深的菌落。

凡系革蘭氏陰性無芽孢桿菌，需再接種于乳糖蛋白陳培養液或乳糖蛋白膝半固體培養基（接種前應將此培養基放入水浴中煮沸排氣，冷卻凝固后方能使用），經37℃培養，前者于24h產酸產氣；或后者經6-8h培養后產氣，則判為總大腸菌群陽性。計數濾膜上生長的大腸菌群菌落總數，根據過濾的水樣量計算1L水樣中總大腸菌群數。

總大腸菌群數（個／L)= 濾膜上生長的大腸桿菌菌落數×1000/過濾水樣量（ml)

濾膜上菌落數以20-60個/片較為適宜。